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支原體等污染物檢測(cè)方法

　　現(xiàn)在只要是做細(xì)胞培養(yǎng)并發(fā)表論文，國(guó)際期刊就要求一定要做支原體檢測(cè)。一般要一周測(cè)一次支原體。
　　細(xì)胞培養(yǎng)中令人頭疼的問(wèn)題之一是支原體的污染。在人們?nèi)粘Ｉ罟ぷ鳝h(huán)境中，支原體無(wú)處不在，它可以通過(guò)人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動(dòng)物的皮毛以及日常的細(xì)胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對(duì)細(xì)胞污染。

　　據(jù)說(shuō)有11%的細(xì)胞株均受到不同程度的支原體污染，更有統(tǒng)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)期的影響。而支原體污染的癥狀不如細(xì)菌、真菌、霉菌污染比較容易辨認(rèn)，一般需要借助其他手段，如PCR、熒光染色試劑盒、培養(yǎng)菌落等方法。

　　造成細(xì)胞污染的支原體有很多，但主要有四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體和萊氏無(wú)膽甾原體。由于支原體體積很小，直徑約在0.2-2.0um之間，可以通過(guò)濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。另外，被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基液體往往并不渾濁，細(xì)胞受損程度并不明顯，形態(tài)很少改變，這樣就更增加了人們對(duì)其的防范難度。
　　支原體檢測(cè)有好幾種方法。藥典規(guī)定有培養(yǎng)法和DNA染色法。
　　現(xiàn)在，PCR和qPCR方法也較為常用。PCR法支原體檢測(cè)原理是針對(duì)支原體16s rRNA保守序列設(shè)計(jì)引物，只要有支原體DNA擴(kuò)增片段即證明有支原體污染存在。
　　qPCR支原體檢測(cè)則除了引物外，還會(huì)用到探針，均熒光素標(biāo)記，從而觀察在FAM通道是否有代表支原體的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。
　　qPCR屬于比較高級(jí)的方法，PCR或者其他方法屬于比較普通的方法，更多用于常規(guī)科研實(shí)驗(yàn)室，PCR也可用于工業(yè)。如用于工業(yè)，則PCR和qPCR均需要完成方法學(xué)驗(yàn)證方案，證明符合歐洲等國(guó)際藥典。
　　支原體檢測(cè)還有其他幾種方法：
　　如生物化學(xué)發(fā)光法：它是通過(guò)支原體酶與特異底物反應(yīng)產(chǎn)生ATP， ATP濃度與其激發(fā)的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從而斷定是否有支原體存在。
　　如細(xì)胞感應(yīng)法，即通過(guò)支原體激活HEK-Blue-2細(xì)胞上的TLR2受體，誘發(fā)分泌堿性磷酸酶，可通過(guò)專有培養(yǎng)基變色檢測(cè)到支原體的存在。
　　每種方法都有自己的長(zhǎng)處和短處，可從結(jié)果是否直觀，操作時(shí)間長(zhǎng)短，靈敏度，檢測(cè)的支原體種類多少，以及是檢支原體DNA還是活的支原體等方面來(lái)評(píng)價(jià)。
　　但對(duì)于工業(yè)放行檢測(cè)而言，迄今為止，只有具有高靈敏度的PCR法或qPCR法才用于工業(yè)，如Minerva Biolabs生產(chǎn)的支原體檢測(cè)試劑盒。而其他方法都是僅能用于科研。

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