（細(xì)胞復(fù)蘇傳代凍存方式）細(xì)胞收貨后處理方法

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（充液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

一、復(fù)蘇細(xì)胞收貨后如何處理？

（1）消毒靜置：75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

注意：若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。請?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

（2）細(xì)胞處理：分貼壁和懸浮細(xì)胞兩種情況：

1、貼壁細(xì)胞：消毒靜置后吸走大部分充液培養(yǎng)基，留10-12ml培養(yǎng)基，拍照并觀察細(xì)胞。密度80%以上即可吸走培養(yǎng)基消化傳代，若密度低于80%可以加10-12 ml新鮮專用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上。

2、懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基）。

（3）細(xì)胞傳代：

1、首次傳代建議1:2傳代，即瓶一T25瓶傳成兩瓶：

①當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。

②在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；

③向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 3ml 無菌的 1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使 PBS 能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS；

④向瓶內(nèi)加入消化液 1ml，浸潤底面后放入 37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育 1~2min；

⑤孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中，將懸液吸入 15ml 離心管；

注：如還有部分細(xì)胞未消化下來，可采用分步消化：

A:準(zhǔn)備一個無菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基；

B:將消化下來的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；

C:向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。

⑥1000rpm 離心 5min；

⑦準(zhǔn)備兩個新的 T-25 培養(yǎng)瓶，各加入 4ml 完全培養(yǎng)基。

⑧離心完成后，棄上清，用 2ml 完全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 2 個 T-25 培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶各 1ml；

⑨水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后，將培養(yǎng)瓶置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2、不增殖的細(xì)胞忽略消化傳代步驟及傳代比例，可以消化后計(jì)數(shù)按實(shí)驗(yàn)需求接種到其他培養(yǎng)容器。

注意事項(xiàng)：若細(xì)胞出現(xiàn)漂浮，T25瓶不開封，放至37度培養(yǎng)箱過夜，若細(xì)胞貼壁即說明活性正常，按正常操作消化傳代即可；若未貼壁，收集細(xì)胞培養(yǎng)基離心后，收集細(xì)胞沉淀用PBS重懸潤洗后采用消化液消化分散，原瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞按正常消化分散，然后將所有細(xì)胞合并后再接種新瓶。

二、細(xì)胞凍存管收貨后如何處理？

（1）如果需要重新凍存，需要轉(zhuǎn)入-80度冰箱保存過夜后，轉(zhuǎn)入液氮罐中可長期保存。

（2）凍存管復(fù)蘇請參考以下步驟：

1、將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到 37℃；

2、準(zhǔn)備一支 15ml 離心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基，放入 37℃水浴鍋中預(yù)熱；

3、戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入 37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動凍存管以提高復(fù)溫速率；

4、將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)備的離心管中，混勻后，1000rpm 離心 5min；

5、準(zhǔn)備一個 T-25 培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入 4ml 完全培養(yǎng)基；

6、離心完成后棄去上清，用 1ml 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入 T-25 細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

7、復(fù)蘇步驟完成后傳代步驟參考上述細(xì)胞傳代①~⑨

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

注意事項(xiàng)：

1、所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。

注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

使用范圍

本公司產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。