染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與新一代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠效率高地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。

1、對(duì)照的選擇

Input對(duì)照：

在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測(cè)。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟。

Beads選擇：

接下來(lái)，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DN***段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

2、抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識(shí)別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實(shí)驗(yàn)的，只有經(jīng)過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的抗體才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

3、陽(yáng)性與陰性對(duì)照：

在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要做好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，因?yàn)闆](méi)有對(duì)照，很難對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性抗體和陰性抗體對(duì)照是基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對(duì)照。較佳的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀（Immunoprecipitation）檢測(cè)。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

4、CHIP實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程

4.1. 交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65oC保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質(zhì)量高，有利于下一步PCR等方法的檢測(cè)。因?yàn)榧兹┎粌H交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)，還交聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，所以還可以對(duì)DNA序列上的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行分析。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。

4.2. DNA的鑒定

常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區(qū)域的序列具有多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同。而且啟動(dòng)子區(qū)域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應(yīng)調(diào)整。有條件可設(shè)計(jì)不止一對(duì)引物來(lái)反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（圖2）。

5、ChIP技術(shù)的應(yīng)用

染色質(zhì)免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗(yàn)證的，可采用狹縫雜交（Slot blot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質(zhì)免疫沉淀的DNA雜交，來(lái)驗(yàn)證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結(jié)合。還可以根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)引物，用半定量PCR的方法進(jìn)行測(cè)定，或采用Real-time PCR方法進(jìn)行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern雜交。但因?yàn)槊庖叱恋淼腄NA量較少，所以在研究時(shí)通常要用PCR方法擴(kuò)增DNA探針，再進(jìn)行整個(gè)基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進(jìn)行測(cè)序，尋找該序列附近的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)新的基因調(diào)節(jié)序列。