1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。

2. 實(shí)驗(yàn)原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線(xiàn)性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分為三類(lèi)：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如a衛(wèi)星、衛(wèi)星III類(lèi)的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物系標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)經(jīng)過(guò)缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記，雜交之后用藕聯(lián)的熒光素的抗生物系的抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用幾輪抗生物素蛋白―熒光素、生物素化的抗―抗生物素蛋白、抗生物素蛋白―熒光素的處理，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。

3. 實(shí)驗(yàn)用具及材料

Y染色體探針、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。

4. 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1）探針及標(biāo)本的變性

（1）探針變性

將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標(biāo)本變性

①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。

③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

2）雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過(guò)夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過(guò)程在濕盒中進(jìn)行。

3）洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。

（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。

（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。

4）雜交信號(hào)的放大

（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。

（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。

（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。

（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。

（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。

（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

5）封片

可采用不同類(lèi)型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周?chē)忾]。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

6）熒光顯微鏡觀(guān)察FISH結(jié)果

先在可見(jiàn)光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開(kāi)熒光激發(fā)光源，FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽(yáng)性，即使在末分裂的細(xì)胞中，也可以觀(guān)察到明顯的雜交信號(hào)。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。