規(guī)格：1×10⁶

儲存條件：活細胞儲存于25℃ ～37℃，收到后請立即放入CO₂培養(yǎng)箱。凍存細胞干冰運輸，暫存于-80℃冰箱，2周有效期；液氮儲存，6個月有效期。

產(chǎn)品簡介：

該產(chǎn)品采用高效心肌定向分化和純化方法產(chǎn)生。同時，包括人多潛能干細胞（hESC/hiPSC）在內(nèi)的所有細胞培養(yǎng)分化過程采用化學成分確定的培養(yǎng)試劑。人心肌細胞主要由具備自主電生理活動的心室肌樣細胞組成，同時也包含少量心房肌和竇房結(jié)樣細胞。這些細胞表達常規(guī)的心肌特異性基因，包括多種收縮蛋白和離子通道。同時，這些細胞具備經(jīng)典的心肌細胞電生理活性，能夠?qū)﹄娚砗蜕锘瘜W刺激做出心肌細胞的常規(guī)反應。以電生理和鈣轉(zhuǎn)導信號記錄為例，這些細胞可以作為新藥篩選，毒理學測定和其他生理學研究的理想工具。

產(chǎn)品內(nèi)容：

培養(yǎng)材料準備：

心肌細胞鋪底工作液包被培養(yǎng)皿/瓶：2-8℃化凍心肌細胞鋪底工作液，往培養(yǎng)皿/瓶中添加工作液至完全覆蓋皿/瓶底，37℃包被過夜備用。如果暫時不用，可用封口膜封口后2～8℃儲存，并于1周內(nèi)使用，保存期間鋪底工作液需始終保持完全覆蓋皿底。

人心肌細胞維持培養(yǎng)基

人心肌細胞復蘇接種完全培養(yǎng)基

人心肌細胞消化液Ⅰ

人心肌細胞消化液Ⅱ

心肌細胞復蘇：

1. 室溫平衡心肌細胞維持培養(yǎng)基，取出包被過鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量心肌細胞維持培養(yǎng)基，置于37℃ CO₂細胞培養(yǎng)箱中。

2. 37℃解凍細胞，快速搖晃使細胞融化至僅剩一小塊冰晶（避免凍存管蓋接觸水面），迅速取出并用75%酒精消毒凍存管外表面，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺中。

3.  用1mL移液器小心的將細胞懸液轉(zhuǎn)移至一個新的15mL離心管，避免劇烈吹吸。

4.  用1mL心肌細胞維持培養(yǎng)基潤洗凍存管，以收集剩余細胞。然后逐滴加入含有細胞懸液的15mL離心管，滴加過程中不斷輕搖混勻。

5. 滴加的速率不變，再依次逐滴加入4mL 心肌細胞維持培養(yǎng)基，滴加過程中不斷輕搖混勻。

6. 200-300g離心5 min。

7. 棄去上清液，用復蘇接種完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕柔吹打混勻，并接種到準備好的培養(yǎng)皿/瓶中，水平十字振動使細胞均勻分布。

注：

心肌細胞傳導動作電位需要細胞間形成連接，能使細胞間形成連接的參考接種密度如下表。其它實驗需求可根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)。心肌細胞復蘇時，細胞量以發(fā)貨單據(jù)上標注的細胞數(shù)為準。不建議將1支細胞 接種于底面積大于10cm²的細胞培養(yǎng)容器中。

8. 37℃恒溫CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，繼續(xù)使用心肌細胞維持培養(yǎng)基。

心肌細胞維持：

1. 心肌細胞維持培養(yǎng)基平衡至室溫。

2. 心肌細胞用心肌細胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48h換液一次；或者加入標準量150%的維 持培養(yǎng)基，每72h換液一次。

3. 細胞在4周內(nèi)性狀穩(wěn)定。

4. 如果需要長期培養(yǎng)，為了維持細胞穩(wěn)定性和純度，需要定期采用心肌細胞純化完全培養(yǎng)基進行處理，一般每4 ～ 6周處理一次。

心肌細胞再接種：

1. 如果需要將心肌細胞按合適密度接種到新的培養(yǎng)皿/瓶中，可對心肌細胞進行再接種，再接種操作會導致20%左右的細胞死亡。

2. 室溫平衡心肌細胞維持培養(yǎng)基、PBS溶液和心肌細胞消化液I\II，取出包被過心肌細胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量心肌細胞維持培養(yǎng)基，置于37℃恒溫CO₂細胞培養(yǎng)箱中。

3. 吸走心肌細胞維持培養(yǎng)基，并且加入PBS溶液洗一次。

4. 加入心肌細胞消化液Ⅰ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

5. 37℃孵育5～10min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞與細胞之間產(chǎn)生一定的縫隙，即達到第一步消化效果。

6. 立即吸去心肌細胞消化液I，然后加入心肌細胞消化液Ⅱ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

7. 37℃孵育，15～20min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞完全變圓，并且在拍打后，大部分細胞漂起，即達到第二步消化效果。

8. 用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的心肌細胞脫落，將細胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，再向皿/瓶中加入適量PBS溶液潤洗皿/瓶底，收集剩余細胞加入15mL離心管。

注：吹打力度要輕柔，避免損傷心肌細胞

9. 200g離心5 min。

10. 棄上清，并且加入5-10mL PBS溶液清洗一次。

11. 200-300g離心5 min。

12. 棄去上清，用心肌細胞復蘇接種完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕柔吹打混勻，并接種到準備好的培養(yǎng)皿/瓶中，水平十字振動使細胞均勻分布。

13. 37℃恒溫CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，繼續(xù)使用心肌細胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

心肌細胞凍存：

1. 如果需要將心肌細胞長期保存，可對心肌細胞進行凍存，凍存操作會導致40%左右的細胞死亡。

2. 室溫平衡PBS溶液和心肌細胞消化液I\II，4℃預冷CryoStor cell cryopreservation

media。

3. 吸走心肌細胞維持培養(yǎng)基，并且加入PBS溶液洗一次。

4. 加入人心肌細胞消化液Ⅰ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

5. 37℃孵育5～10min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞與細胞之間產(chǎn)生一定的縫隙，即達到第一步消化效果。

6. 立即吸去心肌細胞消化液Ⅰ，加入心肌細胞消化液Ⅱ，使之完全覆蓋皿 /瓶底。

7. 37℃孵育，15～20min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞完全變圓，并且在拍打后，大部分細胞漂起，即達到第二步消化效果。

8. 用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的心肌細胞脫落，將細胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，再向皿/瓶中加入適量PBS溶液潤洗皿/瓶底，收集剩余細胞加入15mL離心管中。

注：吹打力度要輕柔，避免損傷心肌細胞

9. 200-300g離心5 min。

10. 棄上清，并且加入5-10mL PBS溶液清洗一次。

11. 200-300g離心5 min

12. 棄去上清，用CryoStor cell cryopreservation media重懸細胞，輕柔吹打混勻。

13. 按復蘇所需要的量，1mL每管凍存。

14. 以1℃每分鐘的速率降至-80℃過夜（一般常見商品化程序降溫盒均可提供此條件）。

15. -80℃過夜后，將凍存細胞轉(zhuǎn)移至液氮保存。

疑難解答：

iPSC derived 心肌細胞是否可以增殖？

iPSC derived 心肌細胞是終末分化的功能細胞，與人體內(nèi)的心肌細胞性質(zhì)相同，不能增殖擴增。

iPSC derived 心肌細胞所含的細胞亞類有哪些？

通過MLC2v、MLC2a和HCN4蛋白的免疫熒光檢測，表明iPSC derived人心肌細胞中含有70～80%的心室肌樣細胞、20～30%的心房肌細胞和＜5%的竇房結(jié)樣細胞。

iPSC derived 心肌細胞是否可以用自己配置的培養(yǎng)基？

iPSC derived心肌細胞配套有心肌細胞維持培養(yǎng)基和心肌細胞純化培養(yǎng)基（心肌細胞富集）。心肌系列培養(yǎng)基可維持心肌細胞在體外長期性狀穩(wěn)定并保持高純度。

如何提高iPSC derived 心肌細胞的復蘇存活率？

iPSC derived 心肌細胞復蘇的要點是：

1. 復蘇過程的時間盡量短，水浴解凍的時間≤90s，轉(zhuǎn)移至超凈臺的過程≤20s，滴加心肌細胞維持培養(yǎng)基，速率應維持在5秒1滴；

2. 由于心肌細胞極易受到物理剪切力的傷害，轉(zhuǎn)移和混勻細胞時要避免劇烈吹吸；

3. 準確控制滴加液體的速度，并在滴加過程中不斷搖晃混勻。

iPSC derived心肌細胞如何形成單層組織？

心肌細胞傳導動作電位需要細胞間形成連接，按照合適的密度接種iPSC derived心肌細胞，可以形成均一的同步化跳動的單層心肌組織。請參考說明書并結(jié)合實際經(jīng)驗，摸索出合適的接種密度。

接種后iPSC derived 心肌細胞沒有跳動怎么辦？

iPSC derived心肌細胞一般在接種后2～3天開始跳動，不超過5天。換液、傳代和在培養(yǎng)箱外長期放置等導致細胞外環(huán)境變化的操作，會使心肌細胞停止跳動。如果心肌細胞長時間不跳動，請檢查培養(yǎng)箱的溫度和CO₂濃度。

iPSC derived 心肌細胞可以在體外穩(wěn)定維持多長時間？

iPSC derived心肌細胞能在3個月內(nèi)維持基因表達的穩(wěn)定性，6個月內(nèi)維持特征與功能的完整性。考慮到非心肌細胞的增殖，1個月以上的研究項目需要每4～6周用心肌細胞純化完全培養(yǎng)基進行一次純化處理。

iPSC derived心肌細胞純化培養(yǎng)基的作用是什么？

iPSC derived心肌細胞純化培養(yǎng)基是根據(jù)心肌細胞的生理特性研發(fā)出的心肌富集試劑盒，非 心肌的細胞在純化培養(yǎng)基中無法存活。純化后2周內(nèi)，心肌細胞的純度可達到99%以上。

心肌細胞停止搏動或搏動緩慢

1. 心肌細胞在再接種操作后，需要1～3天才能恢復搏動；

2. 心肌細胞在換液操作后、或在培養(yǎng)箱外放置過久，會減緩搏動或停止搏動，需要1～3h才能恢復正常搏動；

3. 心肌細胞長時間在心肌細胞純化完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搏動會減緩，需及時停止純化，在心肌細胞維持培養(yǎng)基中恢復4天以上，才能再次純化。