一、細(xì)胞簡介

細(xì)胞簡介

C57BL/6植入c2J囊胚時，毛色嵌合體的得率高；而植入FVB囊胚產(chǎn)生的嵌合體數(shù)量少。ES細(xì)胞可以進(jìn)入FVB/NJ（FVB）和同源突變品系C57BL/6-Tyrc-2J（c2J）這兩個供體宿主囊胚的生殖系。

細(xì)胞名稱

C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞

細(xì)胞貨號

Delf-24674

來源

小鼠，C57BL/6品系，雄性 胚胎內(nèi)細(xì)胞團

形態(tài)特性

球形克隆，貼壁生長

培養(yǎng)條件

1、DMEM培養(yǎng)基+81.5%（貨號：Delf-16563）；

2、優(yōu)質(zhì)胎牛血清+15%（貨號：Delf-11405）；

3、GlutaMAX-1谷氨酰胺+1%（貨號：Delf-16091）；

4、MEM NEAA非必需氨基酸+1%（貨號：Delf-16092）；

5、β-巰基乙醇+1.25 mL（1000X)（貨號：Delf-16101）；

6、LIF+5μg（10ng/mL）（貨號：Delf-16121）；

7、雙抗，1%（貨號：Delf-15487）。

注意：

1、建議使用CF-1  MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

2、在鋪胚胎干細(xì)胞前，需對MEF進(jìn)行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。

3、該細(xì)胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長時間活細(xì)胞運輸，會影響細(xì)胞活力。

培養(yǎng)環(huán)境

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

絲裂霉素滅活MEF

待MEF細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養(yǎng)液，置于37培養(yǎng)箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養(yǎng)基，備用，當(dāng)天2h后或者第二天可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。

二、細(xì)胞復(fù)蘇方法

復(fù)蘇步驟

1、將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2、 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。

3、離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。

4、重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。

5、轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6、每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

三、細(xì)胞傳代方法

傳代比例

1:4-1:7（具體情況視細(xì)胞生長速度及密度決定）

傳代方法

1、一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2、 吸除廢液。

3、用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4、加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。

5、在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6、加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7、以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8、加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。

9、加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

注意事項

不同品牌胰酶消化時間差別較大，可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷消化進(jìn)程

四、細(xì)胞凍存方法

凍存液配方

凍存液：完全培養(yǎng)液 60%，F(xiàn)BS 30%，DMSO 10%現(xiàn)用現(xiàn)配。

凍存規(guī)格

按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

凍存方法

1、按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。

2、以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。

3、按每支存管內(nèi)加入 500μL細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4、將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。

五、注意事項

注意事項

1、所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。

3、本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。

細(xì)胞培養(yǎng)清除試劑