1、穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建流程

穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過(guò)表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系。用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或病毒侵染的方法將構(gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽(yáng)性克隆。針對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源基因在短時(shí)間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量很少，能夠滿足小量蛋白的制備，大量生產(chǎn)成本很高。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛運(yùn)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合，目標(biāo)細(xì)胞廣泛等特點(diǎn)。最常用的真核表達(dá)載體抗性篩選標(biāo)志物有新霉素（neomycin），潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素（puromycin）。常用G418來(lái)代替新霉素進(jìn)行選擇性篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株。

2、準(zhǔn)備及預(yù)實(shí)驗(yàn)

【1】確定目標(biāo)細(xì)胞系的相關(guān)信息

     （1）包括細(xì)胞的培養(yǎng)條件，細(xì)胞的增值速度，支原體污染情況。

【2】預(yù)實(shí)驗(yàn)確定MOI值

     （2）查閱文獻(xiàn)確定慢病毒在目標(biāo)細(xì)胞系中的MOI值

     （3）參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)，摸索最適MOI

【3】預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量

     （1）查閱puro/G418/潮霉素等在目標(biāo)細(xì)胞系中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息

     （2）參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個(gè)藥物濃度梯度（如沒(méi)有相關(guān)信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大數(shù)量增多至6個(gè)）

     （3）第一天將細(xì)胞鋪于6孔板中，使細(xì)胞到第二天的密度約90%

     （4）第二天按設(shè)置的藥物濃度加入藥物

     （5）第四天換液，并重新加入藥物

     （6）第七天觀察，找到細(xì)胞致死率100%時(shí)藥物濃度最低的孔，該孔使用的藥物濃度為藥物篩選濃度

3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株

【1】將復(fù)蘇后常規(guī)的細(xì)胞按照1-3×10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的完全培養(yǎng)基，混合放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜。

【2】第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在無(wú)菌條件下配置如下溶液：a 用250ml的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。b 用250ul的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋6ul的lipo轉(zhuǎn)染試劑。各自孵育5min（血清的存在會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無(wú)血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）

【3】將ab溶液混合，室溫下孵育20min。

【4】在進(jìn)行（2）（3）之前或過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右，用PBS洗滌細(xì)胞一至兩次，每孔加入1.5ml的無(wú)血培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔中，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h。

【5】將轉(zhuǎn)染液倒出，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

【6】48h后加入選擇性抗生素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗生素的殺傷濃度。

4、病毒感染篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株

【1】細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞接種于6孔板中，使細(xì)胞在第二天的密度達(dá)到約70%左右

【2】病毒感染：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的MOI值，計(jì)算需要加入的慢病毒體積

【3】換液：根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行換液，對(duì)于一些耐受弱的細(xì)胞，就要及時(shí)進(jìn)行換液；一些耐受強(qiáng)的細(xì)胞，則可以感染48-72h再進(jìn)行換液

【4】觀察感染效率：感染后72h，觀察感染效率，效率最低不應(yīng)低于40%

【5】 篩選

（1）嘌呤霉素篩選：嘌呤霉素最佳的作用時(shí)間是3-10天之間，嘌呤霉素常用濃度范圍在1-10μg/ml。

 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做病毒感染了。

a.感染: 感染培養(yǎng)72h（感染時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的具體情況及感染效率而定）后在6孔板中加入之前預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的藥物濃度

b.加puro：在6孔板中加入之前預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的puro藥物濃度

 c.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把puro濃度減半維持篩選

d.觀察：每天觀察細(xì)胞的狀態(tài)，生長(zhǎng)情況以及基因表達(dá)的水平及所占比例，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為90%以上。

（2）G418篩選：由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做病毒感染了。

a.感染：感染培養(yǎng)48小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)；

b.加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。

c.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。

 d.觀察：每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及熒光的所占比例，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為90%以上。

（3）潮霉素篩選：潮霉素用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化。推薦使用濃

度為50-1000μg/ml。一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500μg/ml，細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/ml，真菌300-1000μg/ml。對(duì)于第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)建立殺滅曲線即劑量反應(yīng)性曲線，來(lái)確定最佳篩選濃度。

 并非所有的病毒載體都適合用來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定株篩選，首先需要挑選整合效率高，整合位點(diǎn)穩(wěn)定的病毒載體。至今為止，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最有效的可以介導(dǎo)基因整合的病毒載體。其次，依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求，挑選不同整合位點(diǎn)傾向性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

 傾向于整合于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于轉(zhuǎn)錄活躍基因內(nèi)的，容易導(dǎo)致整合區(qū)基因的插入失活。