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免疫熒光三標(biāo)四色（切片）

免疫熒光三標(biāo)四色（切片），服務(wù)介紹：免疫熒光三重標(biāo)記即利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，在同一張切片上3個抗原進(jìn)行同時標(biāo)記，從而實現(xiàn)定位，定性，半定量的分析。實驗流程：1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I10min-環(huán)保型脫蠟液II10min-環(huán)保型脫蠟液III10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒......

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產(chǎn)品詳情

服務(wù)介紹：

免疫熒光三重標(biāo)記即利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，在同一張切片上3個抗原進(jìn)行同時標(biāo)記，從而實現(xiàn)定位，定性，半定量的分析。

實驗流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4、血清封閉: 切片稍甩干，滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8、微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

9、加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

10、加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11、加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12、微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

13、加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

14、加CY5標(biāo)記的熒光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的CY5標(biāo)記熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

15、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

16、淬滅組織自發(fā)熒光：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

17、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

18、切片置于掃描儀下采集圖像:DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光.。CY5激發(fā)波長 608-648nm, 發(fā)射波長672-712,，CY5原本為正紅色，為了與CY3區(qū)分開，我們設(shè)定為粉色光。

技術(shù)原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術(shù)。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野罚街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪氨酸殘基上。此結(jié)合是共價結(jié)合，而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合，通過微波修復(fù)處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標(biāo)記的酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍。在檢測第二個靶標(biāo)時，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需變化不同熒光標(biāo)記即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?

石蠟切片免疫熒光三標(biāo)結(jié)果判讀

DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光，粉光，綠光。

送樣運輸要求：

樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運輸送樣。切勿固定時間過長，切勿冷凍結(jié)冰。熒光三標(biāo)只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片。

常見問題

問：細(xì)胞的運輸方式有哪些？有什么區(qū)別？

答：公司提供兩種運輸方式供老師選擇，1、復(fù)蘇的活細(xì)胞：采用常溫發(fā)貨的方式，收到即可觀察密度并判斷是否進(jìn)行傳代操作。優(yōu)勢是省去復(fù)蘇的步驟，細(xì)胞成活率較高。2、凍存的細(xì)胞：采用干冰運輸，一般情況下發(fā)貨是2支凍存管，收到后放-80過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮長期存儲，擇機(jī)復(fù)蘇。優(yōu)勢是發(fā)貨快，一般一兩天即可收到，缺點是需要自己復(fù)蘇。

問：為什么你們的細(xì)胞和其他公司的細(xì)胞培養(yǎng)條件不一樣？

答：我公司提供的細(xì)胞大部分都參考資源庫的培養(yǎng)信息，如ATCC、DSMZ、中科院等等官方平臺。也有少部分細(xì)胞為客戶提供了替代培養(yǎng)方案，根據(jù)客戶的意愿進(jìn)行選擇！

問：培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液可以重復(fù)使用嗎？

答：不可以重復(fù)使用，一般從我公司發(fā)出的細(xì)胞都需要達(dá)到一定的密度后發(fā)出，充液的培養(yǎng)基血清比例會比正常培養(yǎng)時所用到的培養(yǎng)液低很多，通常在3-5%，以維持細(xì)胞存活，控制生長速度，不可以用來做細(xì)胞培養(yǎng)使用。

問：培養(yǎng)細(xì)胞在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有一些白色的圓點是什么？

答：細(xì)胞在鏡下發(fā)現(xiàn)圓形的白色的點點，一般情況下是為貼壁的細(xì)胞或脫落的細(xì)胞死亡后的產(chǎn)物，懸浮細(xì)胞也會有這種現(xiàn)象，出現(xiàn)圓形的光圈一樣的圓點。通常，白色的圓點是分散分布的，聚團(tuán)類的懸浮細(xì)胞可能會聚團(tuán)出現(xiàn)白色的亮斑，技術(shù)老師可以繼續(xù)培養(yǎng)并觀察。

問：剛買回來的細(xì)胞如何凍存留種呢？

答：一般情況下，我公司建議客戶收到細(xì)胞后傳1-2代后即可安排凍存留種，可先凍存1-2支凍存管，凍存的細(xì)胞數(shù)量多一些，便于后期復(fù)蘇。購買原代細(xì)胞的客戶，要充分考慮該細(xì)胞的傳代次數(shù)限制，人源原代細(xì)胞大概可以傳7代左右，鼠源的可以傳3代左右，對于一些能傳代次數(shù)很少的原代細(xì)胞，不建議凍存，收到后調(diào)整狀態(tài)后即可安排實驗。