一、細(xì)胞簡(jiǎn)介

細(xì)胞名稱

ACE2 Stable Expression Cell Line (293T)

細(xì)胞貨號(hào)

Delf-28859

形態(tài)特性

上皮樣，貼壁生長(zhǎng)

培養(yǎng)條件

DMEM培養(yǎng)基+90%（貨號(hào)：Delf-16563）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%（貨號(hào)：Delf-11405）；

半藥濃度

Puro=1μg/mL

注意：為了維持基因表達(dá)量的穩(wěn)定，建議傳代時(shí)帶藥培養(yǎng)。

培養(yǎng)環(huán)境

氣相：空氣，95%；二氧化碳5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

二、細(xì)胞復(fù)蘇方法

復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備工作：將完全培養(yǎng)液置37℃水浴鍋預(yù)熱30分鐘，隨后將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，轉(zhuǎn)移 到-80℃冰箱，放置數(shù)分鐘讓殘余液氮揮發(fā)；

2)在超凈臺(tái)內(nèi)用吸管吸取6-7 mL 完全培養(yǎng)液至15 mL 離心管中；

3)將細(xì)胞從-80℃冰箱取出暫時(shí)放置于干冰里，復(fù)蘇時(shí)稍稍甩動(dòng)，去除殘留的干冰和液氮，再迅速 用鑷子夾住蓋子放入37℃水浴中快速晃動(dòng)(注意：水不能沒過(guò)蓋子),使其在1分鐘左右完全 融化；

4)在超凈臺(tái)內(nèi)，用酒精棉球擦拭凍存管外壁消毒，稍稍晾干。用單道移液器將所有融化的細(xì)胞懸液 轉(zhuǎn)至提前準(zhǔn)備好的完全培養(yǎng)液中，蓋上蓋子，1100 rpm 室溫離心4分鐘收集細(xì)胞；

5)超凈臺(tái)內(nèi)小心吸棄上清，用單道移液器吸取1 mL 新鮮完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn) 移至裝有4 mL 完全培養(yǎng)液的T25  cm2培養(yǎng)瓶(或者6cm 的皿)中，寫上細(xì)胞名稱、復(fù)蘇日期、 代次，放置37℃、5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

注意：請(qǐng)勿直接復(fù)蘇到T75  cm2瓶或10cm 的皿。

三、細(xì)胞傳代方法

傳代比例

1:3~1:6（具體情況視細(xì)胞生長(zhǎng)速度及密度決定）

傳代方法

1)常規(guī)細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%匯合度即可傳代。在超凈臺(tái)內(nèi)把培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液倒至廢液缸，用1× PBS(T25cm2培養(yǎng)瓶添加約2~3mL,T75   cm2培養(yǎng)瓶約4~5mL) 洗滌細(xì)胞1~2次，以去  除殘余的培養(yǎng)液和血清(血清含有胰酶的抑制因子);

2)加入相應(yīng)體積的胰酶溶液，具體參考附表1,輕輕晃動(dòng)瓶子并使胰酶完全浸過(guò)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放 入培養(yǎng)箱孵育1~2分鐘(若細(xì)胞難以消化，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間),待在顯微鏡下觀察到大部  分細(xì)胞變圓不貼壁，輕輕晃動(dòng)和敲擊培養(yǎng)瓶?jī)蓚?cè)有大量細(xì)胞脫離時(shí)，立即終止消化；

3)加入2倍胰酶體積的完全培養(yǎng)液終止消化，并輕吹打細(xì)胞數(shù)次，使所有細(xì)胞徹底脫壁； (注意： 吹散細(xì)胞時(shí)注意要輕柔，盡量不產(chǎn)生氣泡或盡可能產(chǎn)生少量氣泡。);

4 ) 用 10 mL 移液管轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到一支50 mL 離心管中，同一批次的細(xì)胞可以合并收集在一起， 視情況用適量 PBS 將培養(yǎng)瓶里的殘余細(xì)胞洗下來(lái)， 一起加到50mL 離心管中。蓋上蓋子，做好 標(biāo)記；

5)1100rpm 室溫離心4分鐘，離心后，打開蓋子棄上清，加2mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

6)細(xì)胞按照一定的接種比例傳代，首次按照1:3進(jìn)行傳代，若細(xì)胞在兩天內(nèi)長(zhǎng)滿可增加傳代比 例，若細(xì)胞生長(zhǎng)三四天還未長(zhǎng)滿，可適當(dāng)縮小傳代比例。

注意事項(xiàng)

不同品牌胰酶消化時(shí)間差別較大，可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷消化進(jìn)程

四、細(xì)胞凍存方法

凍存液配方

凍存液：50%DMEM+40%FBS+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

凍存規(guī)格

按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

凍存方法

1)按細(xì)胞傳代的方法，在超凈臺(tái)內(nèi)把培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞進(jìn)行消化至單細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)基終止反 應(yīng)。所有液體轉(zhuǎn)移到一支50 mL 離心管中。

2)用移液管吹打混合均勻，取20 μL 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；

3)1100rpm 室溫離心4分鐘，離心后，打開蓋子倒去上清，用1~2 mL4℃  預(yù)冷的凍存液重懸細(xì) 胞，隨后加入凍存液調(diào)整至密度為1x10?-1x10? 個(gè)細(xì)胞/mL。

4)將細(xì)胞懸液按1 mL/ 管平均分裝至凍存管中，旋緊蓋子，凍存管應(yīng)提前貼好細(xì)胞名稱、細(xì)胞代 次、數(shù)量、凍存日期；

5)將凍存管放置于4℃預(yù)冷的程序降溫盒中，并在凍存結(jié)束的15分鐘之內(nèi)將程序降溫盒放置超低 溫冰箱內(nèi)；

6)過(guò)夜后，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)保存。

五、注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)

1、所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

3、本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動(dòng)物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。

細(xì)胞培養(yǎng)清除試劑