細(xì)胞介紹

通過外植技術(shù)衍生自惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤。該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因。

細(xì)胞特性

1）來源：U251膠質(zhì)瘤耐藥篩選

2）形態(tài)：貼壁細(xì)胞

3）含量：>1×10? 細(xì)胞數(shù)

4）用途：僅供科研使用。

細(xì)胞運(yùn)輸、保存及注意事項(xiàng)

細(xì)胞耐藥誘導(dǎo)過程

待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導(dǎo)劑量，每個(gè)劑量保持至細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)至匯合度達(dá)50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。約8個(gè)月后，細(xì)胞可在16μg/mL TMZ藥物濃度下穩(wěn)定生長(zhǎng)，視為耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功，并命名為U251 MG/TMZ。

細(xì)胞培養(yǎng)試劑的配制

1）TMZ藥物的配制及保存

建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其完全溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月，-80℃保存6個(gè)月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制

細(xì)胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2~3day換液。

注意：

①細(xì)胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的TMZ濃度；

②建議復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)始終穿戴防護(hù)手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細(xì)胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當(dāng)體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落。迅速拿回操作臺(tái)，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細(xì)胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻。將細(xì)胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個(gè)新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2~3day換液。

注意：細(xì)胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加TMZ藥物。若加藥后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的TMZ濃度。

3）細(xì)胞凍存

①細(xì)胞凍存時(shí)，步驟同2）細(xì)胞傳代的①~④，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入配制好的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，按照1×10?~1×10?個(gè)細(xì)胞/mL分配到一個(gè)凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

1、所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

使用范圍

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動(dòng)物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。