試劑盒使用說明書 本試劑僅供研究使用
　　試劑盒價格：48T: 1350元  96T:2350元
　　目的：本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組 織勻漿及相關(guān)液體樣本中甲胎蛋白異質(zhì)體 3（AFP-L3）的含量。

　　實驗原理： 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）水平。用純化 的大鼠甲胎蛋白異質(zhì)體 3（AFP-L3）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中 依次加入大鼠甲胎蛋白異質(zhì)體 3（AFP-L3），再與 HRP 標記的檢測抗體結(jié)合，形成抗體-抗原 -酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠甲胎蛋白異質(zhì)體 3（AFP-L3） 呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中大鼠甲 胎蛋白異質(zhì)體 3（AFP-L3）含量。

　　樣本處理及要求：
　　1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集 上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
　　2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次 離心。
　　3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程 中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
　　4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)
　　2 /分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞 濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20 分 鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
　　5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將 標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢 測，其余冷凍備用。
　　6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上 進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
　　7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
　　操作步驟
　　1. 標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50μL；。
　　2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣 品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl （樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃 動混勻。
　　3. 加酶：每孔加入酶標試劑 100μl，空白孔除外。
　　4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。
　　5. 配液：將 20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。
　　6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。
　　7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯 色 15 分鐘.
　　8. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液 后 15 分鐘以內(nèi)進行。
　　注意事項：
　　1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡 60 分鐘。
　　2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
　　3． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
　　4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計 算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
　　5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　6． 底物請避光保存。
　　7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
　　8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
　　9． 本試劑不同批號組分不得混用。
　　10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

　　計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

（此圖僅供參考）

　　試劑盒性能：
　　1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.95 以上。
　　2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于 10%和 15% 。
　　檢測范圍： 2 ng/mL - 64 ng/mL
　　靈敏度： 最低檢測濃度小于 0.1 ng/mL
　　保存條件及有效期：
　　1.試劑盒保存： 2-8℃。
　　2．有效期： 6 個月