【產(chǎn)品名稱】

中文名稱：人外周血 CD4+T 細胞

英文名稱：Human Peripheral Blood CD4+ T Cells

【預期用途】

可作為多種領域研究所需的原材料。

【貯藏條件與有效期】

置于液氮保存，有效期為 24 個月；

生產(chǎn)日期，有效期至：見標簽。

【產(chǎn)品簡介】

CD4 分子系細胞表面糖蛋白，MHC Ⅱ類限制性抗原誘導 T 細胞活化的共受體。正常表達見于在皮質(zhì)胸腺細胞表面與 CD8 同時表達，而在大部分末期胸腺細胞和成熟 T 細胞只表達 CD4而不表達 CD8。幼稚髓系細胞、嗜酸粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和郎罕氏細胞均可表達 CD4。

異常表達見于急性 T 淋巴細胞白血病的原始細胞、成熟 T 細胞淋巴瘤的腫瘤細胞，有時也可表達于急性髓細胞白血病的原始細胞，尤其是 M4 或 M5，亦可表達于郎罕氏組織細胞增多癥。三一造血利用自有的 Flosep-C 細胞分離純化技術從外周血中純化出 CD4 +輔助 T 細胞，經(jīng)流式檢測，其純度大于 85%，純化后置于液氮保存。

【操作步驟】

所需試劑：

(1)IMDM，α-MEM 或 RPMI-1640      (2) FBS     (3) DNase I

操作流程：

1 準備好 37°C 水浴，將 RPMI-1640 與 FBS 溫浴至 37°C；

2 生物安全柜中，配制含 10% FBS 的培養(yǎng)基（IMDM, α-MEM 或 RPMI-1640 均可），待用；

3 從液氮中取出 CD3+CD4+T 細胞凍存管，置于-80°C 超低溫冰箱中數(shù)分鐘，使凍存管中的液氮揮發(fā)，而后迅速將其置于 37°C 溫水中，并快速水平晃動，使其內(nèi)含物盡快融化，直至凍存管固體內(nèi)含物余下一小冰屑后取出凍存管；

注意：

1）從液氮中取出凍存管時，往往在凍存管里含有液氮，最好先將凍存管先置于超低溫冰箱中， 使液氮揮發(fā)，再進行水浴化凍的操作；

2）盡可能將凍存管的內(nèi)含物全部浸沒于 37°C 溫水中，使內(nèi)含物均勻融化；

3) 請勿使溫水沒過凍存管蓋的螺口，以防污染；

4) 細胞復蘇的操作過程要迅速，避免影響細胞復蘇后的活性。

5) 采用正選（Positive selection）方法分離的細胞因細胞表面標記有磁珠，故可能凍存管中細胞顏色較深，此為正常現(xiàn)象，不影響后續(xù)復蘇和使用。

4 在將凍存管拿進生物安全柜之前，用 75%酒精對其表面進行消毒；

5 輕輕重懸細胞，并將其移入裝有 100μg DNase I 的 50mL 離心管里；

注意：

1）加入 DNase I 可有效減少細胞復蘇后細胞團塊的產(chǎn)生；

2）DNase I 的使用是非必須的，對于 DNA, RNA 等的提取目的可不使用。

6 用 1mL 培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將此懸液以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 離心管中，并且同時輕輕搖晃離心管，使滴加的懸液混勻；

7 吸取 15-20mL 的培養(yǎng)基以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 離心管中，并且同時輕輕搖晃離心管，使滴加的懸液混勻；

注意：第 5,6,7 步驟可使細胞中的 DMSO 緩慢均勻的滲透出來，最大程度保證細胞安全，但操作較為緩慢，若有多個樣品需要處理時，可以將操作步驟更改為：

5’：輕輕重懸細胞，并將其移入裝有 100μg DNase I 的 15mL 離心管里；

6’：用 1mL 培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將此懸液合并到到 15mL 離心管里；

7’：吸取 10mL 培養(yǎng)基，直接加入到 15mL 離心管中，反復輕柔吹打或上下顛倒混勻，室溫孵育 10min；

8 室溫下，300g 離心 10min；

9 迅速使用移液槍吸走上清，剩余少許液體，并輕輕吹打液體使細胞懸浮；

注意：

1）離心結(jié)束后，盡快吸走上清；

2) 吹打液體時動作要輕，避免損傷細胞，并且吹打時盡可能避免氣泡產(chǎn)生。

10 緩慢加入 15-20mL 新鮮培養(yǎng)基（快速法中則只要在 15mL 離心管中加入 10mL 培養(yǎng)基即可）， 并同時輕輕搖晃離心管；

11 室溫下，300g 離心 10min；

注意：采用正選（Positive selection）方法分離的細胞因細胞表面標記有磁珠，故離心后管中細胞沉淀顏色較深，此為正常現(xiàn)象，不影響后續(xù)使用。

12 迅速使用移液槍吸走上清，剩余少許液體，并輕輕吹打液體使細胞懸浮，此 CD3+CD4+T 細胞即可用于下游實驗。

【產(chǎn)品性能指標】

產(chǎn)品性能符合本企業(yè)制定的產(chǎn)品技術要求。

【重要說明】

1 本項服務所需細胞材料必須符合國家遺傳資源相關法律規(guī)定。如有需要，三一造血可協(xié)助使用方取得倫理批件及申請人類遺傳資源行政許可；

2 細胞分離服務所得細胞僅限用于科學研究使用，不得用于臨床診斷及臨床治療，否則由此引起一切后果由使用方承擔。