規(guī)格：1×10⁶

儲(chǔ)存條件：活細(xì)胞儲(chǔ)存于25℃ ～37℃，收到后請(qǐng)立即放入CO₂培養(yǎng)箱。凍存細(xì)胞干冰運(yùn)輸，暫存于-80℃冰箱，2周有效期；液氮儲(chǔ)存，6個(gè)月有效期。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

該產(chǎn)品采用高效心肌定向分化和純化方法產(chǎn)生。同時(shí)，包括人多潛能干細(xì)胞（hESC/hiPSC）在內(nèi)的所有細(xì)胞培養(yǎng)分化過(guò)程采用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)試劑。人心肌細(xì)胞主要由具備自主電生理活動(dòng)的心室肌樣細(xì)胞組成，同時(shí)也包含少量心房肌和竇房結(jié)樣細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)常規(guī)的心肌特異性基因，包括多種收縮蛋白和離子通道。同時(shí)，這些細(xì)胞具備經(jīng)典的心肌細(xì)胞電生理活性，能夠?qū)﹄娚砗蜕锘瘜W(xué)刺激做出心肌細(xì)胞的常規(guī)反應(yīng)。以電生理和鈣轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)記錄為例，這些細(xì)胞可以作為新藥篩選，毒理學(xué)測(cè)定和其他生理學(xué)研究的理想工具。

產(chǎn)品內(nèi)容：

培養(yǎng)材料準(zhǔn)備：

心肌細(xì)胞鋪底工作液包被培養(yǎng)皿/瓶：2-8℃化凍心肌細(xì)胞鋪底工作液，往培養(yǎng)皿/瓶中添加工作液至完全覆蓋皿/瓶底，37℃包被過(guò)夜備用。如果暫時(shí)不用，可用封口膜封口后2～8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用，保存期間鋪底工作液需始終保持完全覆蓋皿底。

人心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基

人心肌細(xì)胞復(fù)蘇接種完全培養(yǎng)基

人心肌細(xì)胞消化液Ⅰ

人心肌細(xì)胞消化液Ⅱ

心肌細(xì)胞復(fù)蘇：

1. 室溫平衡心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，取出包被過(guò)鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，置于37℃ CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2. 37℃解凍細(xì)胞，快速搖晃使細(xì)胞融化至僅剩一小塊冰晶（避免凍存管蓋接觸水面），迅速取出并用75%酒精消毒凍存管外表面，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)中。

3.  用1mL移液器小心的將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的15mL離心管，避免劇烈吹吸。

4.  用1mL心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基潤(rùn)洗凍存管，以收集剩余細(xì)胞。然后逐滴加入含有細(xì)胞懸液的15mL離心管，滴加過(guò)程中不斷輕搖混勻。

5. 滴加的速率不變，再依次逐滴加入4mL 心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，滴加過(guò)程中不斷輕搖混勻。

6. 200-300g離心5 min。

7. 棄去上清液，用復(fù)蘇接種完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打混勻，并接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿/瓶中，水平十字振動(dòng)使細(xì)胞均勻分布。

注：

心肌細(xì)胞傳導(dǎo)動(dòng)作電位需要細(xì)胞間形成連接，能使細(xì)胞間形成連接的參考接種密度如下表。其它實(shí)驗(yàn)需求可根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)。心肌細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，細(xì)胞量以發(fā)貨單據(jù)上標(biāo)注的細(xì)胞數(shù)為準(zhǔn)。不建議將1支細(xì)胞 接種于底面積大于10cm²的細(xì)胞培養(yǎng)容器中。

8. 37℃恒溫CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，繼續(xù)使用心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基。

心肌細(xì)胞維持：

1. 心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基平衡至室溫。

2. 心肌細(xì)胞用心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48h換液一次；或者加入標(biāo)準(zhǔn)量150%的維 持培養(yǎng)基，每72h換液一次。

3. 細(xì)胞在4周內(nèi)性狀穩(wěn)定。

4. 如果需要長(zhǎng)期培養(yǎng)，為了維持細(xì)胞穩(wěn)定性和純度，需要定期采用心肌細(xì)胞純化完全培養(yǎng)基進(jìn)行處理，一般每4 ～ 6周處理一次。

心肌細(xì)胞再接種：

1. 如果需要將心肌細(xì)胞按合適密度接種到新的培養(yǎng)皿/瓶中，可對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行再接種，再接種操作會(huì)導(dǎo)致20%左右的細(xì)胞死亡。

2. 室溫平衡心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基、PBS溶液和心肌細(xì)胞消化液I\II，取出包被過(guò)心肌細(xì)胞鋪底工作液的培養(yǎng)皿/瓶，吸去包被液并加入適量心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，置于37℃恒溫CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

3. 吸走心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，并且加入PBS溶液洗一次。

4. 加入心肌細(xì)胞消化液Ⅰ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

5. 37℃孵育5～10min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間產(chǎn)生一定的縫隙，即達(dá)到第一步消化效果。

6. 立即吸去心肌細(xì)胞消化液I，然后加入心肌細(xì)胞消化液Ⅱ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

7. 37℃孵育，15～20min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完全變圓，并且在拍打后，大部分細(xì)胞漂起，即達(dá)到第二步消化效果。

8. 用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的心肌細(xì)胞脫落，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，再向皿/瓶中加入適量PBS溶液潤(rùn)洗皿/瓶底，收集剩余細(xì)胞加入15mL離心管。

注：吹打力度要輕柔，避免損傷心肌細(xì)胞

9. 200g離心5 min。

10. 棄上清，并且加入5-10mL PBS溶液清洗一次。

11. 200-300g離心5 min。

12. 棄去上清，用心肌細(xì)胞復(fù)蘇接種完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打混勻，并接種到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿/瓶中，水平十字振動(dòng)使細(xì)胞均勻分布。

13. 37℃恒溫CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，繼續(xù)使用心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

心肌細(xì)胞凍存：

1. 如果需要將心肌細(xì)胞長(zhǎng)期保存，可對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行凍存，凍存操作會(huì)導(dǎo)致40%左右的細(xì)胞死亡。

2. 室溫平衡PBS溶液和心肌細(xì)胞消化液I\II，4℃預(yù)冷CryoStor cell cryopreservation

media。

3. 吸走心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，并且加入PBS溶液洗一次。

4. 加入人心肌細(xì)胞消化液Ⅰ，使之完全覆蓋皿/瓶底。

5. 37℃孵育5～10min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間產(chǎn)生一定的縫隙，即達(dá)到第一步消化效果。

6. 立即吸去心肌細(xì)胞消化液Ⅰ，加入心肌細(xì)胞消化液Ⅱ，使之完全覆蓋皿 /瓶底。

7. 37℃孵育，15～20min，于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞完全變圓，并且在拍打后，大部分細(xì)胞漂起，即達(dá)到第二步消化效果。

8. 用移液器扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的心肌細(xì)胞脫落，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，再向皿/瓶中加入適量PBS溶液潤(rùn)洗皿/瓶底，收集剩余細(xì)胞加入15mL離心管中。

注：吹打力度要輕柔，避免損傷心肌細(xì)胞

9. 200-300g離心5 min。

10. 棄上清，并且加入5-10mL PBS溶液清洗一次。

11. 200-300g離心5 min

12. 棄去上清，用CryoStor cell cryopreservation media重懸細(xì)胞，輕柔吹打混勻。

13. 按復(fù)蘇所需要的量，1mL每管凍存。

14. 以1℃每分鐘的速率降至-80℃過(guò)夜（一般常見(jiàn)商品化程序降溫盒均可提供此條件）。

15. -80℃過(guò)夜后，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮保存。

疑難解答：

iPSC derived 心肌細(xì)胞是否可以增殖？

iPSC derived 心肌細(xì)胞是終末分化的功能細(xì)胞，與人體內(nèi)的心肌細(xì)胞性質(zhì)相同，不能增殖擴(kuò)增。

iPSC derived 心肌細(xì)胞所含的細(xì)胞亞類有哪些？

通過(guò)MLC2v、MLC2a和HCN4蛋白的免疫熒光檢測(cè)，表明iPSC derived人心肌細(xì)胞中含有70～80%的心室肌樣細(xì)胞、20～30%的心房肌細(xì)胞和＜5%的竇房結(jié)樣細(xì)胞。

iPSC derived 心肌細(xì)胞是否可以用自己配置的培養(yǎng)基？

iPSC derived心肌細(xì)胞配套有心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基和心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基（心肌細(xì)胞富集）。心肌系列培養(yǎng)基可維持心肌細(xì)胞在體外長(zhǎng)期性狀穩(wěn)定并保持高純度。

如何提高iPSC derived 心肌細(xì)胞的復(fù)蘇存活率？

iPSC derived 心肌細(xì)胞復(fù)蘇的要點(diǎn)是：

1. 復(fù)蘇過(guò)程的時(shí)間盡量短，水浴解凍的時(shí)間≤90s，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)的過(guò)程≤20s，滴加心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基，速率應(yīng)維持在5秒1滴；

2. 由于心肌細(xì)胞極易受到物理剪切力的傷害，轉(zhuǎn)移和混勻細(xì)胞時(shí)要避免劇烈吹吸；

3. 準(zhǔn)確控制滴加液體的速度，并在滴加過(guò)程中不斷搖晃混勻。

iPSC derived心肌細(xì)胞如何形成單層組織？

心肌細(xì)胞傳導(dǎo)動(dòng)作電位需要細(xì)胞間形成連接，按照合適的密度接種iPSC derived心肌細(xì)胞，可以形成均一的同步化跳動(dòng)的單層心肌組織。請(qǐng)參考說(shuō)明書并結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，摸索出合適的接種密度。

接種后iPSC derived 心肌細(xì)胞沒(méi)有跳動(dòng)怎么辦？

iPSC derived心肌細(xì)胞一般在接種后2～3天開始跳動(dòng)，不超過(guò)5天。換液、傳代和在培養(yǎng)箱外長(zhǎng)期放置等導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境變化的操作，會(huì)使心肌細(xì)胞停止跳動(dòng)。如果心肌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間不跳動(dòng)，請(qǐng)檢查培養(yǎng)箱的溫度和CO₂濃度。

iPSC derived 心肌細(xì)胞可以在體外穩(wěn)定維持多長(zhǎng)時(shí)間？

iPSC derived心肌細(xì)胞能在3個(gè)月內(nèi)維持基因表達(dá)的穩(wěn)定性，6個(gè)月內(nèi)維持特征與功能的完整性。考慮到非心肌細(xì)胞的增殖，1個(gè)月以上的研究項(xiàng)目需要每4～6周用心肌細(xì)胞純化完全培養(yǎng)基進(jìn)行一次純化處理。

iPSC derived心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基的作用是什么？

iPSC derived心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基是根據(jù)心肌細(xì)胞的生理特性研發(fā)出的心肌富集試劑盒，非 心肌的細(xì)胞在純化培養(yǎng)基中無(wú)法存活。純化后2周內(nèi)，心肌細(xì)胞的純度可達(dá)到99%以上。

心肌細(xì)胞停止搏動(dòng)或搏動(dòng)緩慢

1. 心肌細(xì)胞在再接種操作后，需要1～3天才能恢復(fù)搏動(dòng)；

2. 心肌細(xì)胞在換液操作后、或在培養(yǎng)箱外放置過(guò)久，會(huì)減緩搏動(dòng)或停止搏動(dòng)，需要1～3h才能恢復(fù)正常搏動(dòng)；

3. 心肌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間在心肌細(xì)胞純化完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搏動(dòng)會(huì)減緩，需及時(shí)停止純化，在心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基中恢復(fù)4天以上，才能再次純化。