一、細(xì)胞簡介

細(xì)胞描述

該細(xì)胞系被報(bào)道具有生殖能力，源自一個(gè)攜帶LacZ報(bào)告基因的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠。這段轉(zhuǎn)基因在pUC19中組裝，包含1.9 kb人54 HS-2片段（兩側(cè)KpnI/PvuII酶切位點(diǎn)），位于標(biāo)記的?-珠蛋白轉(zhuǎn)基因上游。培養(yǎng)時(shí)需使用昆明白MEF（SCSP-101R）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

細(xì)胞名稱

B6-BLU 小鼠胚胎干細(xì)胞

細(xì)胞別稱

B6-BLU

細(xì)胞貨號(hào)

Delf-27175

來源

小鼠，57BL/6Tac品系 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

細(xì)胞形態(tài)

球形克隆

生長特性

貼壁細(xì)胞

培養(yǎng)條件

準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（81.5%）      

優(yōu)質(zhì)胎牛血清（15%）

GlutaMAX-1谷氨酰胺（1%）

MEM NEAA非必需氨基酸（1%）

P/S青霉素-鏈霉素（1%）

β-巰基乙醇（1.25 mL）

LIF（10ng/mL）

注意：

1、建議使用KM- MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

2、在鋪胚胎干細(xì)胞前，需對MEF進(jìn)行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。

3、該細(xì)胞建議凍存干冰發(fā)貨，不適合長時(shí)間活細(xì)胞運(yùn)輸，會(huì)影響細(xì)胞活力。

培養(yǎng)環(huán)境

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

二、細(xì)胞復(fù)蘇方法

復(fù)蘇步驟

1. 將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。

5. 轉(zhuǎn)移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

三、細(xì)胞傳代方法

傳代比例

1:4-1:7

傳代方法

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

注意事項(xiàng)

不同品牌胰酶消化時(shí)間差別較大，可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷消化進(jìn)程

四、細(xì)胞凍存方法

凍存液配方

完全培養(yǎng)液 60%，F(xiàn)BS 30%，DMSO 10%現(xiàn)用現(xiàn)配。

我?guī)靸龃鏁r(shí)，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會(huì)形成 30 至 40 個(gè)克隆，建議復(fù)蘇至 1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中。

凍存規(guī)格

按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

凍存方法

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。

2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。

五、注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)

1、所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

3、本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動(dòng)物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。

附：

小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時(shí)。

3.  1 小時(shí)后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。