一、細(xì)胞簡(jiǎn)介

細(xì)胞簡(jiǎn)介

細(xì)胞殺傷 T 細(xì)胞屬于 T 淋巴細(xì)胞的亞群，可誘導(dǎo)受感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的死亡。大多數(shù) T 淋巴細(xì)胞表達(dá)表達(dá)可識(shí)別與 I 類(lèi) MHC 分子和 CD8 糖蛋白結(jié)合的特異性抗原肽的 T 細(xì)胞受體。細(xì)胞利用自有的 Flosep-C 細(xì)胞分離純化技術(shù)從外周血中純化出 CD8 +殺傷 T 細(xì)胞，經(jīng)流式檢測(cè)，其純度大于 80%，純化后置于液氮保存。

細(xì)胞名稱(chēng)

人外周血 CD8+T 細(xì)胞

細(xì)胞貨號(hào)

Delf-28846

規(guī)格

1M

二、操作步驟

所需試劑

1、IMDM，α-MEM 或 RPMI-1640

2、FBS

3、DNase I

操作流程

1、準(zhǔn)備好 37°C 水浴，將 RPMI-1640 與 FBS 溫浴至 37°C；

2、生物安全柜中，配制含 10%FBS 的培養(yǎng)基（IMDM, α-MEM 或 RPMI-1640 均可），待用；

3、從液氮中取出 CD3+CD8+ T 細(xì)胞凍存管，置于-80°C 超低溫冰箱中數(shù)分鐘，使凍存管中的液氮揮發(fā)，而后迅速將其置于 37°C 溫水中，并快速水平晃動(dòng)，使其內(nèi)含物盡快融化，直至凍存管固體內(nèi)含物余下一小冰屑后取出凍存管；

注意：

1）從液氮中取出凍存管時(shí)，往往在凍存管里含有液氮，最好先將凍存管先置于超低溫冰箱中，使液氮揮發(fā)，再進(jìn)行水浴化凍的操作；

2）盡可能將凍存管的內(nèi)含物全部浸沒(méi)于 37°C 溫水中，使內(nèi)含物均勻融化；

3) 請(qǐng)勿使溫水沒(méi)過(guò)凍存管蓋的螺口，以防污染；

4) 細(xì)胞復(fù)蘇的操作過(guò)程要迅速，避免影響細(xì)胞復(fù)蘇后的活性。

5) 采用正選（Positive selection）方法分離的細(xì)胞因細(xì)胞表面標(biāo)記有磁珠，故可能凍存管中細(xì)胞顏色較深，此為正常現(xiàn)象，不影響后續(xù)復(fù)蘇和使用。

4、在將凍存管拿進(jìn)生物安全柜之前，用 75%酒精對(duì)其表面進(jìn)行消毒；

5、輕輕重懸細(xì)胞，并將其移入裝有 100μg DNase I 的 50mL 離心管里；

注意：

1）加入 DNase I 可有效減少細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞團(tuán)塊的產(chǎn)生；

2）DNase I 的使用是非必須的，對(duì)于 DNA, RNA 等的提取目的可不使用。

6、用 1mL 培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將此懸液以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 離心管中，并且同時(shí)輕輕搖晃離心管，使滴加的懸液混勻；

7、吸取 15-20mL 的培養(yǎng)基以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 離心管中，并且同時(shí)輕輕搖晃離心管，使滴加的懸液混勻；

注意：第 5,6,7 步驟可使細(xì)胞中的 DMSO 緩慢均勻的滲透出來(lái)，最大程度保證細(xì)胞安全，但操作較為緩慢，若有多個(gè)樣品需要處理時(shí)，可以將操作步驟更改為：

5’：輕輕重懸細(xì)胞，并將其移入裝有 100μg DNase I 的 15mL 離心管里；

6’：用 1mL 培養(yǎng)基沖洗凍存管，并將此懸液合并到到 15mL 離心管里；

7’：吸取 10mL 培養(yǎng)基，直接加入到 15mL 離心管中，反復(fù)輕柔吹打或上下顛倒混勻，室溫孵育 10min；

8、室溫下，300g 離心 10min；

9、迅速使用移液槍吸走上清，剩余少許液體，并輕輕吹打液體使細(xì)胞懸浮；

注意：

1）離心結(jié)束后，盡快吸走上清；

2) 吹打液體時(shí)動(dòng)作要輕，避免損傷細(xì)胞，并且吹打時(shí)盡可能避免氣泡產(chǎn)生。

10、緩慢加入 15-20mL 新鮮培養(yǎng)基（快速法中則只要在 15mL 離心管中加入 10mL 培養(yǎng)基即可），

并同時(shí)輕輕搖晃離心管；

11、室溫下，300g 離心 10min；

注意：采用正選（Positive selection）方法分離的細(xì)胞因細(xì)胞表面標(biāo)記有磁珠，故離心后管中細(xì)胞沉淀顏色較深，此為正常現(xiàn)象，不影響后續(xù)使用。

12、迅速使用移液槍吸走上清，剩余少許液體，并輕輕吹打液體使細(xì)胞懸浮，此 CD3+CD8+ T 細(xì)胞即可用于下游實(shí)驗(yàn)。

三、注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)

1、所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒(méi)在液氮中會(huì)泄漏，并會(huì)慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。

3、本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動(dòng)物或人類(lèi)疾病的治療產(chǎn)品使用。

細(xì)胞培養(yǎng)清除試劑