細胞介紹

一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株。

注：本培養(yǎng)基是不直接添加吉西他濱藥物的。如果客戶需要直接添加的我們可以按照客戶的意愿添加吉西他濱藥物。

細胞特性

1）來源：ASPC-1耐藥篩選

2）形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

3）含量：>1×10?細胞數(shù)             

4）用途：僅供科研使用

細胞運輸、保存及注意事項：干冰運輸及復(fù)蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照以下處理方法操作：

1、收到細胞請先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀、細胞的狀態(tài)，進行拍照并保存，如有問題請及時聯(lián)系我們；

2、收到的復(fù)蘇細胞，若有較多細胞飄起，可能由于運輸導(dǎo)致。請先置于37℃細胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h，待細胞貼壁后再做處理；

3、復(fù)蘇細胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，收到細胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基；

4、建議收到細胞后，首先進行擴增，并凍存部分細胞以備用。

細胞耐藥誘導(dǎo)過程

待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導(dǎo)劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。約10個月后，細胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構(gòu)建成功，并命名為ASPC-1/GEM。

細胞培養(yǎng)試劑的配制

1）GEM藥物的配制及保存

建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物，使其完全溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致藥物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制

細胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細胞處理

1）凍存細胞的復(fù)蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：

①細胞復(fù)蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度；

②建議復(fù)蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當(dāng)體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度。

3）細胞凍存

①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數(shù)后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10? ~ 1×10?個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項：

1、所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2、建議在復(fù)蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。

使用范圍

本產(chǎn)品僅限于科學(xué)研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產(chǎn)品使用。