細胞介紹

通過外植技術衍生自惡性膠質母細胞瘤腫瘤。

細胞特性

1）來源：U251膠質瘤耐藥篩選

2）形態(tài)：貼壁細胞

3）含量：>1×10⁶細胞數

4）用途：僅供科研使用。

細胞運輸、保存及注意事項：干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照以下處理方法操作：

1、收到細胞請先就培養(yǎng)瓶/凍存管的外觀、細胞的狀態(tài)，進行拍照并保存，如有問題請及時聯(lián)系我們；

2、收到的復蘇細胞，若有較多細胞飄起，可能由于運輸導致。請先置于37℃細胞培養(yǎng)箱中靜置2~4h，待細胞貼壁后再做處理；

3、復蘇細胞充液培養(yǎng)基為不含藥物的維持培養(yǎng)基，收到細胞后請及時更換為完全培養(yǎng)基；

4、建議收到細胞后，首先進行擴增，并凍存部分細胞以備用。

細胞耐藥誘導過程

待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。約8個月后，細胞可在16μg/mL TMZ藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構建成功，并命名為U251 MG/TMZ。

細胞培養(yǎng)試劑的配制

1）TMZ藥物的配制及保存

建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其完全溶解。

注意：可根據用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）完全培養(yǎng)基的配制

細胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細胞處理

1）凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：

①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度；

②建議復蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞完全貼壁，形態(tài)完全展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度。

3）細胞凍存

①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10⁶ ~ 1×10⁷個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

使用范圍

本產品僅限于科學研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產品使用。