酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實(shí)驗(yàn)

　　酶免疫測(cè)定（enzyme immunoassay, EIA）或免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic technique）是指用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。
　　酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。（2）研究抗酶抗體的合成。（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。（4）定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
　　目前常用的方法稱為酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。
　　ELISA是由抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

　　實(shí)驗(yàn)方法

　　1.標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；。
　　2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
　　3.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。
　　4.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
　　5.配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
　　6.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
　　7.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
　　8.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　9.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。