慢病毒（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。通過包裝的慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá) shRNA，被廣泛地應(yīng)用于表達(dá) RNAi 的研究中。

慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝shRNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而效率高地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。

一：慢病毒包裝過程

1.293細(xì)胞密度接近90%左右時(shí)進(jìn)行傳代，加入37℃預(yù)熱的胰酶進(jìn)行消化，將消化離心混勻后的細(xì)胞種于10mm培養(yǎng)皿。將細(xì)胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育24h,當(dāng)細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的50％以上時(shí)轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒。

2.取兩個(gè)無菌1.5mlEP管，分別加入200μl無血清DMEM，其中一個(gè)EP管內(nèi)加入1.5μg含有目的基因的病毒載體核心質(zhì)粒和1.5μg病毒包裝質(zhì)粒，病毒包裝質(zhì)粒可按照pMDL:VSVG:REV=5:3:2比例加入；另一個(gè)EP管中加入6μl lipo2000。

3.靜止5分鐘。然后將兩管充分混勻，靜置15-20min。

4.將步驟3中的混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)平皿混勻，然后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育。

4. 10h-16h后吸去培養(yǎng)基，加入適量37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細(xì)胞放置溫箱孵育。

5.轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm離心五分鐘。

6.將待轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞平鋪于35mm培養(yǎng)皿，12-24h后換液，較佳密度為30%－50％。第一次加入轉(zhuǎn)染后24h收集的病毒液培養(yǎng)。可根據(jù)情況進(jìn)行病毒液的再次感染。細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代或者檢測(cè)表達(dá)。

如果一次包裝的病毒液體積較大，可以通過PEG8000進(jìn)行慢病毒液的濃縮，PEG 是環(huán)氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子型聚合物， 多用于濃縮病毒。

二：慢病毒濃縮過程

1. 配制5X PEG8000：

NaCl 8.766 g;

PEG8000 50g；

200ml Milli-Q純水；

溶解后將液體至于121℃ 高溫滅菌30min；將滅菌后母液保存在4℃。

2. 使用0.45μm濾頭過濾轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清液；

3. 每30ml過濾后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；

4. 每20～30min混合一次，8字搖勻，共進(jìn)行3-5次；

5. 4℃放置過夜；

6. 4℃，4000 g，離心 20min

7. 吸棄上清，靜置管子1～2min，吸走殘余液體；

8. 加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

9.將溶解病毒懸液分裝，儲(chǔ)存在-80 ℃，按需取用。