一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜

目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒 DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。

一個合格質(zhì)粒的組成要素：

（1）復(fù)制起始位點 Ori 即控制復(fù)制起始的位點。原核生物 DNA 分子中只有一個復(fù)制起始點。而

真核生物 DNA 分子有多個復(fù)制起始位點。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段

（4） P/E 啟動子/增強子

（5）Terms 終止信號

（6）加 poly（A）信號可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目

的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

載體選擇主要考慮下述3點：

【1】構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

【2】.載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb 選質(zhì)粒。

（2）表達載體據(jù)受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。

（3）對原核表達載體應(yīng)該注意：選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌，用于表達真核蛋白質(zhì)時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

【3】載體 MCS 中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)生閱讀框架錯位。

綜上所述，選用質(zhì)粒（常用）做載體的5點要求：

（1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

（2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束，一般 10個以上的拷貝，而嚴謹型質(zhì)粒<10個。

（3）需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

（4）需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

（5）滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標記，是否需要加入標簽蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進行切割，獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進行連接。

如何閱讀質(zhì)粒圖譜

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞。

（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418（長那霉素衍生物）失活

（5）hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點以外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。克隆載體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇世K。

第六步：啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號

（1）啟動子－促進 DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。

（2）增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負增強子，負調(diào)控序列。

（3）核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

（4）轉(zhuǎn)錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。

質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據(jù)表達宿主不同，構(gòu)建時所選擇的載體也會不同。

二、目的基因的獲得

一般來說，目的基因的獲得有三種途徑：

調(diào)取基因：根據(jù)目的基因的序列，設(shè)計引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調(diào)取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進行測序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對成本較低，但是調(diào)取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達豐度不同，轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜，或是基因片段很長，這些情況都很難調(diào)取到目的基因。

全基因合成：根據(jù)目的基因的DNA序列，直接設(shè)計合成目的基因。此方法準確性高，相對成本會高一些，個人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列，同時可以進行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內(nèi)的表達量。

三、克隆構(gòu)建

目前，克隆構(gòu)建的方法多種多樣，除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點的克隆構(gòu)建方式。下面具體說一下雙酶切方法構(gòu)建載體的步驟。