一、 檢測原理

全基因合成miR潛在結合位點上下游~500bp（LncRNA、circRNA或mRNA的3’UTR）野生形式WT及結合位點的突變形式Mut，克隆到psiCHECK-2多克隆位點處（1640-1674）（圖1），然后與miR的mimics/NC共同轉染293T細胞測定熒光素酶讀值即可。

圖1 雙熒光素酶載體示意圖.

二、 載體構建與Mimics合成

1. 構建WT miR潛在結合位點到psiCHECK-2載體，命名為WT；

2.構建Mut miR潛在結合位點到psiCHECK-2載體，命名為Mut（突變模式：A/T與G/C互變）；

3.合成待測miR的Mimmics及陰性對照NC。

三、 實驗分組信息

四、 具體實驗步驟：

(一) 細胞轉染操作步驟

1.事先準備好用于轉染的分到96孔板中的293T 細胞和目的質粒，待細胞密度達到50%-70%為宜。

2.將10 ml DMEM與0.16 mg的lncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的質粒以及5 pmol的miR/Negative.Control（N.C）Mimics充分混勻后室溫放置（溶液A）；然后將10 ml DMEM與0.3 ml 的轉染試劑（轉染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter，濃度為0.8 mg/ml）充分混勻（溶液B），室溫放置5 min。

3.將溶液A與溶液B充分混勻，室溫放置20 min。

4.轉染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基，之后將轉染混合物加入混勻。37℃，5% CO2培養(yǎng)。

5.轉染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基，轉染48 h后收集細胞檢測。

(二) 檢測實驗操作步驟

檢測試劑盒：Promega Dual-Luciferase system

1、將5′PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸餾水稀釋至1′PLB，以96孔板每孔100 ml的量加入，用移液槍吹打打散細胞，置于室溫搖床上緩慢搖15分鐘后，將細胞裂解液吸至1.5 ml離心管，4度12000 rpm （13200g）離心10 min，取上清移入新的管子；

2、96孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml；

3、加入20 ml細胞裂解液，移液槍吹打混勻2-3次，測定記錄Firefly luciferase值，此值為內參值。

4、加入100 ml Stop & Glo? Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema)，移液槍吹打混勻2-3次，測定記錄Renilla luciferase值，此即為報告基因發(fā)光值。

五、 預期實驗結果