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原位雜交（FISH、IF雙染）

原位雜交（FISH、IF雙染），服務(wù)介紹：原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。IF即免疫熒光，可檢測(cè)組織或細(xì)胞中某蛋白的表達(dá)情況及定位。原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測(cè)靶基因與靶蛋白的共定位情況。實(shí)驗(yàn)流程：石蠟切片熒光探針原位雜交與免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定......

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服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。IF即免疫熒光，可檢測(cè)組織或細(xì)胞中某蛋白的表達(dá)情況及定位。

原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測(cè)靶基因與靶蛋白的共定位情況。

實(shí)驗(yàn)流程：石蠟切片熒光探針原位雜交與免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過(guò)夜。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9、孵育一抗：滴加一抗，PBS稀釋。4°過(guò)夜。后PBS洗3×5min。

10、孵育二抗：滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育50min。后PBS洗3×5min。

11、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

10.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光;FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光。)

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無(wú)酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。

常見(jiàn)問(wèn)題

問(wèn)：細(xì)胞的運(yùn)輸方式有哪些？有什么區(qū)別？

答：公司提供兩種運(yùn)輸方式供老師選擇，1、復(fù)蘇的活細(xì)胞：采用常溫發(fā)貨的方式，收到即可觀察密度并判斷是否進(jìn)行傳代操作。優(yōu)勢(shì)是省去復(fù)蘇的步驟，細(xì)胞成活率較高。2、凍存的細(xì)胞：采用干冰運(yùn)輸，一般情況下發(fā)貨是2支凍存管，收到后放-80過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期存儲(chǔ)，擇機(jī)復(fù)蘇。優(yōu)勢(shì)是發(fā)貨快，一般一兩天即可收到，缺點(diǎn)是需要自己復(fù)蘇。

問(wèn)：為什么你們的細(xì)胞和其他公司的細(xì)胞培養(yǎng)條件不一樣？

答：我公司提供的細(xì)胞大部分都參考資源庫(kù)的培養(yǎng)信息，如ATCC、DSMZ、中科院等等官方平臺(tái)。也有少部分細(xì)胞為客戶提供了替代培養(yǎng)方案，根據(jù)客戶的意愿進(jìn)行選擇！

問(wèn)：培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液可以重復(fù)使用嗎？

答：不可以重復(fù)使用，一般從我公司發(fā)出的細(xì)胞都需要達(dá)到一定的密度后發(fā)出，充液的培養(yǎng)基血清比例會(huì)比正常培養(yǎng)時(shí)所用到的培養(yǎng)液低很多，通常在3-5%，以維持細(xì)胞存活，控制生長(zhǎng)速度，不可以用來(lái)做細(xì)胞培養(yǎng)使用。

問(wèn)：培養(yǎng)細(xì)胞在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有一些白色的圓點(diǎn)是什么？

答：細(xì)胞在鏡下發(fā)現(xiàn)圓形的白色的點(diǎn)點(diǎn)，一般情況下是為貼壁的細(xì)胞或脫落的細(xì)胞死亡后的產(chǎn)物，懸浮細(xì)胞也會(huì)有這種現(xiàn)象，出現(xiàn)圓形的光圈一樣的圓點(diǎn)。通常，白色的圓點(diǎn)是分散分布的，聚團(tuán)類的懸浮細(xì)胞可能會(huì)聚團(tuán)出現(xiàn)白色的亮斑，技術(shù)老師可以繼續(xù)培養(yǎng)并觀察。

問(wèn)：剛買回來(lái)的細(xì)胞如何凍存留種呢？

答：一般情況下，我公司建議客戶收到細(xì)胞后傳1-2代后即可安排凍存留種，可先凍存1-2支凍存管，凍存的細(xì)胞數(shù)量多一些，便于后期復(fù)蘇。購(gòu)買原代細(xì)胞的客戶，要充分考慮該細(xì)胞的傳代次數(shù)限制，人源原代細(xì)胞大概可以傳7代左右，鼠源的可以傳3代左右，對(duì)于一些能傳代次數(shù)很少的原代細(xì)胞，不建議凍存，收到后調(diào)整狀態(tài)后即可安排實(shí)驗(yàn)。