項目介紹：

該項技術(shù)是組織樣品經(jīng)低溫脫水滲透LR White樹脂低溫聚合包埋，超薄切片70-80nm，用特異性一抗與待檢測抗原結(jié)合然后用帶有膠體金標記的二抗與一抗抗原復合物結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于二抗上的膠體金形成一定的電子密度而精確指示出相應抗原在亞細胞水平上的定位。

樣本準備：

組織取下后立即投入免疫電鏡專用固定液，4°保存，4°冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。樣品固定后應盡快安排做后續(xù)包埋和免疫標記實驗，減少抗原丟失的可能性。

注意事項：

1、1-3min內(nèi)取樣，取樣組織1mm³大小。取材前可提前準備裝有免疫電鏡固定液A液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿的固定液中進行切割成1mm³的小組織塊。再將切割好的小組織塊轉(zhuǎn)移至裝有新的免疫電鏡固定液的EP管內(nèi)繼續(xù)固定。

2、取材時盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進行固定）。

3、取材時一定注意避免鑷子擠壓等機械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

實驗步驟：

1、取材固定

組織：新鮮組織確定取材部位，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機械損傷，1-3min內(nèi)取樣，取樣組織1mm³大小。取材前可提前準備裝有免疫電鏡固定液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿的固定液中進行切割成1mm³的小組織塊。再將切割好的小組織塊轉(zhuǎn)移至裝有新的免疫電鏡固定液的EP管內(nèi)繼續(xù)固定，4℃固定保存及運輸。

細胞、細菌：離心收集細胞或細菌沉淀，要求沉淀最少綠豆大小。加入免疫電鏡專用固定液重懸混勻固定，4℃固定保存及運輸。

2、清洗

組織：用4℃預冷的0.1M磷酸緩沖液PB（pH7.4）在冰盒上漂洗3次，每次10min。

細胞、細菌：細胞或細菌用高速冷凍離心機4℃離心，棄上清加入4℃預冷的0.1M磷酸緩沖液PB（PH7.4），混勻漂洗3min后再離心，重復洗滌3次。提前加熱溶解制備2%瓊脂糖溶液，待冷卻至40℃左右后加入EP管內(nèi)，在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起懸浮包裹于瓊脂糖內(nèi)。在第一次漂洗時，可加入微量品紅染液，使細胞著色，有利于后續(xù)切片定位。

3、脫水：預冷后的梯度酒精進行脫水，依次為30%酒精4℃ 20min，50%酒精-20℃ 20min，70%酒精-20℃ 20min，80%酒精-20℃10min，85%酒精-20℃ 10min，90%酒精-20℃ 10min，95%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min。

4、樹脂滲透：100%酒精：純樹脂=2:1  4℃  1h；100%酒精：純樹脂=1:1  4℃  3h；100%酒精：純樹脂=1:2  4℃  17-20h；純樹脂  4℃  17-20h；純樹脂  4℃  2次，1h/次。

5、包埋：4℃，先將純樹脂滴入包埋膠囊中，然后將樣本放入純樹脂中并扣上膠囊帽進行包埋，抽真空0.5h-1h后扣緊膠囊帽。

6、聚合：低溫紫外聚合儀-20℃進行聚合48h以上，后恢復室溫，取出樹脂塊備用。