服務(wù)介紹：

抗原抗體的結(jié)合非常特異。免疫熒光雙標(biāo)是用兩種不同種屬來(lái)源的抗體共同孵育同一張組織切片，兩種抗體分別與兩種目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，然后再用帶有不同顏色的熒光染料標(biāo)記的第二抗體分別與其對(duì)應(yīng)的第一抗體結(jié)合，在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光去激發(fā)染料發(fā)出兩種不同的熒光，進(jìn)而將兩種不同目標(biāo)蛋白通過(guò)間接標(biāo)記的方式用兩種熒光顯示出來(lái)。也可以利用TSA技術(shù)進(jìn)行熒光標(biāo)記，有信號(hào)放大的作用同時(shí)可以不限制一抗的種屬，同源或異源一抗都可以標(biāo)記。TSA技術(shù)主要原理為用HRP標(biāo)記的第二抗體與第一抗體結(jié)合后，再孵育熒光標(biāo)記的酪胺（TSA），TSA在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街谀繕?biāo)蛋白周?chē)牡鞍桌野彼釟埢希私Y(jié)合是共價(jià)結(jié)合。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合。通過(guò)高溫和微波處理，非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉，而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周?chē)M(jìn)而將靶標(biāo)通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái)。每輪標(biāo)記都按一抗-二抗-TSA的順序?qū)ο鄳?yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記，每輪染色只需改變TSA熒光染料種類(lèi)即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)用不同熒光染料進(jìn)行共同標(biāo)記。在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用熒光染料對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光去激發(fā)染料發(fā)出熒光進(jìn)而將目標(biāo)蛋白通過(guò)間接標(biāo)記的方式顯示出來(lái)。

切片數(shù)字掃描是通過(guò)控制顯微成像系統(tǒng)和切片以一定的規(guī)則運(yùn)動(dòng)，采集多張連續(xù)的高分辨率顯微圖像再無(wú)縫拼接生成一張高分辨率的組織切片全景圖像。該圖像包含了玻片上所有的信息，可在電腦上用瀏覽軟件任意放大和縮小，任意部位觀察采圖，是真正脫離顯微鏡的閱片方式。通過(guò)在掃描儀上加載與免疫標(biāo)記時(shí)熒光染料匹配的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的濾光塊，獲取不同熒光通道的圖像。可單通道，多通道任意組合瀏覽并按需采圖。

掃描的熒光圖像可以用軟件對(duì)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行半定量分析，用數(shù)據(jù)去評(píng)價(jià)陽(yáng)性的強(qiáng)弱。對(duì)于陽(yáng)性為單個(gè)細(xì)胞表達(dá)的指標(biāo)可以做陽(yáng)性細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析，對(duì)于陽(yáng)性為成片表達(dá)的指標(biāo)可以做陽(yáng)性面積相關(guān)參數(shù)的分析。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)包含：各指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞比率、陽(yáng)性細(xì)胞密度、陽(yáng)性強(qiáng)度。一次分析即可獲取各指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)的三個(gè)數(shù)值。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)均可用于評(píng)價(jià)陽(yáng)性強(qiáng)弱多少，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇應(yīng)用。陽(yáng)性面積相關(guān)參數(shù)包含：陽(yáng)性面積比，陽(yáng)性強(qiáng)度。一次分析即可獲取各指標(biāo)陽(yáng)性面積相關(guān)參數(shù)的兩個(gè)數(shù)值。陽(yáng)性面積相關(guān)參數(shù)均可用于評(píng)價(jià)陽(yáng)性強(qiáng)弱多少，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇應(yīng)用。

送樣運(yùn)輸要求：

1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片或者冰凍切片。置于固定液內(nèi)的組織切勿冷凍結(jié)冰，切勿固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。細(xì)胞爬片用通用型組織固定液固定，封口膜封好防止漏液，常溫保存運(yùn)輸。

2、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸。冰凍切片-20°保存運(yùn)輸。

實(shí)驗(yàn)流程：

熒光二抗法：石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細(xì)胞爬片無(wú)需此步）——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈血清封閉——同時(shí)孵育兩種異源一抗——同時(shí)孵育對(duì)應(yīng)種屬的兩種熒光二抗——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像——數(shù)據(jù)分析。

TSA法：石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細(xì)胞爬片無(wú)需此步）——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA ——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像——數(shù)據(jù)分析。