項(xiàng)目介紹：

該項(xiàng)技術(shù)是組織樣品經(jīng)低溫脫水滲透LR White樹脂低溫聚合包埋，超薄切片70-80nm，用特異性一抗與待檢測(cè)抗原結(jié)合然后用帶有膠體金標(biāo)記的二抗與一抗抗原復(fù)合物結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于二抗上的膠體金形成一定的電子密度而精確指示出相應(yīng)抗原在亞細(xì)胞水平上的定位。

樣本準(zhǔn)備：

組織取下后立即投入免疫電鏡專用固定液，4°保存，4°冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。樣品固定后應(yīng)盡快安排做后續(xù)包埋和免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，減少抗原丟失的可能性。

注意事項(xiàng)：

1、1-3min內(nèi)取樣，取樣組織1mm³大小。取材前可提前準(zhǔn)備裝有免疫電鏡固定液A液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿的固定液中進(jìn)行切割成1mm³的小組織塊。再將切割好的小組織塊轉(zhuǎn)移至裝有新的免疫電鏡固定液的EP管內(nèi)繼續(xù)固定。

2、取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。

3、取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、取材固定

組織：新鮮組織確定取材部位，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，1-3min內(nèi)取樣，取樣組織1mm³大小。取材前可提前準(zhǔn)備裝有免疫電鏡固定液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿的固定液中進(jìn)行切割成1mm³的小組織塊。再將切割好的小組織塊轉(zhuǎn)移至裝有新的免疫電鏡固定液的EP管內(nèi)繼續(xù)固定，4℃固定保存及運(yùn)輸。

細(xì)胞、細(xì)菌：離心收集細(xì)胞或細(xì)菌沉淀，要求沉淀最少綠豆大小。加入免疫電鏡專用固定液重懸混勻固定，4℃固定保存及運(yùn)輸。

2、清洗

組織：用4℃預(yù)冷的0.1M磷酸緩沖液PB（pH7.4）在冰盒上漂洗3次，每次10min。

細(xì)胞、細(xì)菌：細(xì)胞或細(xì)菌用高速冷凍離心機(jī)4℃離心，棄上清加入4℃預(yù)冷的0.1M磷酸緩沖液PB（PH7.4），混勻漂洗3min后再離心，重復(fù)洗滌3次。提前加熱溶解制備2%瓊脂糖溶液，待冷卻至40℃左右后加入EP管內(nèi)，在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起懸浮包裹于瓊脂糖內(nèi)。在第一次漂洗時(shí)，可加入微量品紅染液，使細(xì)胞著色，有利于后續(xù)切片定位。

3、脫水：預(yù)冷后的梯度酒精進(jìn)行脫水，依次為30%酒精4℃ 20min，50%酒精-20℃ 20min，70%酒精-20℃ 20min，80%酒精-20℃10min，85%酒精-20℃ 10min，90%酒精-20℃ 10min，95%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min，100%酒精-20℃ 10min。

4、樹脂滲透：100%酒精：純樹脂=2:1  4℃  1h；100%酒精：純樹脂=1:1  4℃  3h；100%酒精：純樹脂=1:2  4℃  17-20h；純樹脂  4℃  17-20h；純樹脂  4℃  2次，1h/次。

5、包埋：4℃，先將純樹脂滴入包埋膠囊中，然后將樣本放入純樹脂中并扣上膠囊帽進(jìn)行包埋，抽真空0.5h-1h后扣緊膠囊帽。

6、聚合：低溫紫外聚合儀-20℃進(jìn)行聚合48h以上，后恢復(fù)室溫，取出樹脂塊備用。