產(chǎn)品描述

JC-1是一種陽(yáng)離子羰花青染料，能夠穿過細(xì)胞膜，在線粒體膜電位的作用下向線粒體聚集定位，是廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1在線粒體膜電位作用下聚集在線粒體的基質(zhì)中，其主要以聚合物(J-aggregates)的形式存在，呈現(xiàn)出紅色熒光(Ex=585 nm，Em=590 nm)；當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不好，線粒體膜電位下降或者喪失，會(huì)導(dǎo)致JC-1大多以單體(Monomer)的形式存在于胞漿中，呈現(xiàn)出綠色熒光(Ex=514 nm，Em=529 nm)。因此，可以根據(jù)熒光顏色的紅綠轉(zhuǎn)化以及比例變化來判斷線粒體膜電位變化情況，而線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要標(biāo)志。

JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit)是一種以JC-1熒光探針為主的試劑盒，本試劑盒對(duì)JC-1易析出等缺點(diǎn)進(jìn)行了改良，并在試劑盒中提供了相關(guān)試劑，可用于快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞或純化的線粒體膜電位變化，用于判斷早期的細(xì)胞凋亡，也是用來檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的常用方法。本試劑盒共可以檢測(cè)100個(gè)6孔板樣品；此外，本試劑盒中還提供CCCP(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)試劑，是一種線粒體中氧化磷酸化的質(zhì)子載體(氫離子載體)和解耦體，能夠促使線粒體對(duì)氫離子的通透性發(fā)生變化，導(dǎo)致線粒體膜電位下降或者喪失，可作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸

冰袋(wet ice)運(yùn)輸；

-20℃保存；JC-1(500×)需避光保存，避免反復(fù)凍融；JC-1染色緩沖液(10×)和JC-1稀釋液可4℃保存；有效期12個(gè)月。

組成

操作步驟

1. JC-1染色工作液以及JC-1染色緩沖液配制：

a. 取2 μLJC-1溶液(500×)與900 μL JC-1稀釋液充分混勻，然后再加入100 μL JC-1染色緩沖液(10×)，旋渦震蕩混勻，配制成JC-1染色工作液備用(注意按順序配制此溶液)；

b. 取適量JC-1染色緩沖液(10×)用去離子水稀釋配制成1×JC-1染色緩沖液備用(后續(xù)步驟如無特殊說明，洗滌等步驟均使用1×JC-1染色緩沖液)。

2. 陽(yáng)性對(duì)照組設(shè)置：

a. 取適量CCCP(100 mM)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋1000倍得到100 μM CCCP工作液;

b. 用CCCP工作液孵育細(xì)胞30 min左右，隨后按照下方的JC-1染色步驟操作檢測(cè)線粒體膜電位。

(注意：對(duì)于大部分細(xì)胞來說，上述處理方式處理過后，相比正常組，CCCP處理誘導(dǎo)后可以看到JC-1大多以單體的形式存在于胞漿中，呈現(xiàn)出較亮的綠色熒光，紅色熒光變?nèi)酰坏怯行┘?xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定或優(yōu)化體系摸索最優(yōu)條件。)

3. 懸浮細(xì)胞染色操作：

a. 取1-6×10⁵細(xì)胞，1000 g離心3-5 min去除原有培養(yǎng)基，加入JC-1染色緩沖液洗滌1次后，再離心去除JC-1染色緩沖液，用500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基重懸(可含血清和酚紅)；

b. 然后加入500 μLJC-1染色工作液，避光于CO₂培養(yǎng)箱中孵育15-30 min(一般情況20 min即可，也可視情況調(diào)整孵化時(shí)間)；

c. 孵育結(jié)束后，依舊按常規(guī)懸浮細(xì)胞的處理方法，離心去除JC-1染色工作液后，用JC-1染色緩沖液洗滌2次；

d. 適量JC-1染色緩沖液(1×)或細(xì)胞培養(yǎng)液(建議不含酚紅)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可使用流式細(xì)胞儀等儀器分析。

4. 貼壁細(xì)胞染色操作(6孔板為例)：

對(duì)于貼壁細(xì)胞，如需用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

a. 去除原有含藥物或其他處理的細(xì)胞培養(yǎng)基后，加1 mL JC-1染色緩沖液，洗滌1-2次；

b. 加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基(可含血清和酚紅)；

c. 加入1 mL JC-1染色工作液，輕晃混勻，避光于CO₂培養(yǎng)箱中孵育15-30 min；

d. 孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液，洗滌2次；

e. 加入2 mL JC-1染色緩沖液(1×)或細(xì)胞培養(yǎng)液(建議不含酚紅)；

e. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察或用流式細(xì)胞儀等儀器分析。

5. 對(duì)于提取純化的線粒體

a. 900 μL JC-1染色工作液中加入100 μL總蛋白量為10-100 μg純化線粒體；

b. 混勻后使用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm)或酶標(biāo)儀(當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為485 nm時(shí)，可以在475～520 nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng))等儀器進(jìn)行掃描檢測(cè)，也可通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，可參考步驟6中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)。

6. 熒光檢測(cè)與分析

a. 檢測(cè)JC-1單體的波長(zhǎng)參數(shù)為Ex=490 nm, Em=525 nm；JC-1聚合物的波長(zhǎng)參數(shù)為Ex=525 nm, Em=590 nm；注意此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)，參數(shù)設(shè)置可以依情況在這參數(shù)左右進(jìn)行一個(gè)調(diào)整；

b. 熒光顯微鏡拍照時(shí)，建議以正常組為標(biāo)準(zhǔn)，確定紅色和綠色熒光的曝光時(shí)間，以正常組紅色熒光效果清晰，綠色熒光效果較暗為佳，并分別以正常組的紅色與綠色熒光的曝光時(shí)間去拍攝處理組熒光；

c. 對(duì)結(jié)果的判斷：細(xì)胞狀態(tài)正常，主要呈現(xiàn)紅色熒光，表明其線粒體膜電位正常；如果出現(xiàn)綠色熒光大幅度增強(qiáng)，說明線粒體膜電位出現(xiàn)下降，其可能處于細(xì)胞凋亡早期階段。

注意事項(xiàng)

1. 為了使JC-1充分溶解，請(qǐng)按照操作順序進(jìn)行JC-1工作液配制。

2. JC-1孵育過后的樣品，建議30 min內(nèi)檢測(cè)完畢。

3. JC-1溶液、JC-1染色緩沖液(10×)如有沉淀生產(chǎn)，可以適當(dāng)溫浴溶解。

4. JC-1最終檢測(cè)時(shí)，建議使用不含酚紅的細(xì)胞培養(yǎng)液，避免造成背景色干擾，JC-1染色孵育階段酚紅對(duì)結(jié)果無影響。

5. 如每次使用的JC-1溶液較少，可能要涉及多次的反復(fù)凍融，請(qǐng)視情況分裝，盡量避免JC-1溶液多次反復(fù)凍融。

6. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。